文章亮点

1. 关键发现

• 与当前常用的眼内注射视网膜色素上皮细胞或分散酶构建的小鼠增殖性玻璃体视网膜病变模型相比，联合注射基质胶和视网膜色素上皮细胞能更完整地模拟人增殖性玻璃体视网膜病变增殖膜形成的病理表型，且不会造成严重的视网膜损伤，可用于增殖性玻璃体视网膜病变发病机制及抗纤维化药物研究。

2. 已知与发现

• 目前报道的增殖性玻璃体视网膜病变小鼠模型主要通过眼内注射细胞、分散酶或眼内手术操作等方法建立，但不同模型在模拟增殖性玻璃体视网膜病变膜形成、模型稳定性和眼球损伤程度方面存在差异，对人增殖性玻璃体视网膜病变进程的模拟效果欠佳。

• 联合注射基质胶和视网膜色素上皮细胞能促进孔源性视网膜脱离模型中视网膜周围纤维增殖膜的形成，减少非特异性组织损伤，更好地模拟增殖性玻璃体视网膜病变膜形成的主要病理表型。

3. 意义与改变

• 本研究提供了一种改良的增殖性玻璃体视网膜病变动物模型，为相关研究提供了更多的模型选择。

       增殖性玻璃体视网膜病变(proliferative vitreoretinopathy, PVR)是孔源性视网膜脱离及其手术治疗后导致视网膜再次脱离的重要原因之一^[1-2]。其主要病理特征为视网膜周围纤维化增殖膜的形成^[3]，其中以视网膜前膜和视网膜下膜为典型^[4-5]。增殖膜通常无法自愈，会因持续生长和扩散对视野造成遮挡^[6]，或因持续收缩牵拉引发更严重的视力损害^[7]。视网膜色素上皮细胞(retinal pigment epithelium, RPE)是一层排列规则的单层色素上皮，起着维持血-视网膜屏障和视网膜稳态的重要作用。在视网膜脱离或视网膜裂孔形成后，RPE细胞会被破坏并发生上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)转化为成纤维样细胞^[8]，从而获得增强的迁移、增殖、细胞外基质合成和收缩能力^[9-11]，这是导致PVR发展的核心因素。

       模拟临床病理特征且稳定的动物模型是研究PVR发病机制和评价潜在新型治疗策略的重要基础。目前常用的PVR动物造模方式主要包括眼内注射细胞、眼内注射酶或手术操作^[12-13]。眼内注射细胞主要模拟PVR进程中细胞迁移变化的特征，其中以注射RPE细胞最为常见^[14]，但其诱导的视网膜增殖膜成膜率有限。另一种常见的造模方式为眼内注射分散酶(dispase)，该操作相对简便，但对视网膜组织的损伤较大，可能超过临床PVR的原发病理过程^[15]。而手术操作的造模方式如晶状体取出术^[5]、人工视网膜脱离联合RPE损伤^[16-17]等，更多是诱导眼球损伤，对增殖膜的诱发能力比较局限，影响了PVR病变的观察。因此，亟需进一步构建更加合理的PVR动物模型，以推动PVR致病机制研究。

       本研究对对照组、RPE细胞组、基质胶组、分散酶组及基质胶联合RPE细胞组建立的PVR小鼠模型进行比较，通过眼底照相、光学相干断层扫描(optical coherence tomography, OCT)、苏木精-伊红(hematoxylin-eosin, HE)和纤维连接蛋白(Fibronectin)染色评估各组病理特征，重点分析基质胶联合RPE细胞模型在视网膜周围增殖膜形成、视网膜脱离及眼球形态结构完整性等方面的病理特点，为PVR动物模型的合理选择提供依据。

1. 材料与方法

1.1 实验动物

       选取6~7周龄SPF级C57BL/6J雌性小鼠，购自广东药康生物科技有限公司，实验动物生产许可证号：SCXK(粤)2025-0054。小鼠饲养于中山大学中山眼科中心实验动物中心(SPF级)，定期更换垫料并给予充足的饲料和水，明/暗周期为12 h/12 h。本研究所涉及的动物实验和操作均经中山大学中山眼科中心伦理委员会批准(批件号：Z2021002)，所有实验均遵循实验动物福利伦理原则。

1.2 主要试剂与仪器

       基质胶Matrigel(BD Biocoat，35623)；Dispase(Macklin，9068-59-1)；磷酸盐缓冲液(Gibco，10010023)；DMEM/F12培养基(Corning，11320033)；0.25%胰酶消化液(Gibco，25200056)；胎牛血清(Gibco，A5669701)；青霉素-链霉素(Gibco，15140122)；MCE膜过滤器(MF-Millipore，GSWP04700)；OCT包埋剂(SAKURA，4583)；DAPI(Sigma，D9564-10MG)；微量注射针(Hamilton，7632-01)；Fibronectin抗体(Sigma，F3648)；抗兔荧光标记二抗(Multi Sciences Biotech，GAR007)；小动物OCT(Optical Coherence Tomography)成像系统(Phoenix Research Labs，Micron IV)；激光共聚焦显微镜LSM 710(Zeiss)。

1.3 RPE细胞培养

       ARPE-19细胞(人视网膜色素上皮细胞系)购自美国ATCC公司，培养于含10%胎牛血清和1%青霉素-链霉素的DMEM/F12培养基中，置于37 ℃、5% CO₂培养箱内培养。

1.4 动物分组及PVR模型建立

       小鼠随机分为以下5组：对照组、RPE细胞组和基质胶组每组5只，分散酶组和基质胶联合RPE细胞组每组13只。对照组予玻璃体腔注射PBS(1.5 μL)；RPE细胞组予玻璃体腔注射RPE细胞(1×10⁴个细胞，1 µL)；基质胶组予视网膜下注射基质胶(Matrigel，1.5 μL)；分散酶组予玻璃体腔注射分散酶(dispase，0.005 U，1 µL)；基质胶联合RPE细胞组予首先进行视网膜下注射基质胶(1.5 μL)，1周后进行玻璃体腔注射RPE细胞(1×10⁴个细胞，1 µL)。

       PVR模型建立：实验开始前准备好无菌PBS(经0.45 µm滤器过滤)、基质胶(Matrigel，1.5 μL/眼)、分散酶(0.005 U/μL)及RPE细胞悬液(1×10⁴个/μL)。采用戊巴比妥钠对小鼠进行全身麻醉，滴用复方托吡卡胺散瞳。于手术显微镜下使用Hamilton微量注射针吸取2.5 µL药液，经角膜缘后1~2 mm处进针进入眼球(避开晶状体和视网膜血管)，根据分组行玻璃体腔或视网膜下注射。注射结束后缓慢拔针，并于结膜囊内涂布复方妥布霉素眼膏预防感染。术后定期观察小鼠角膜、晶状体及眼底情况。对照组、RPE细胞组、基质胶组和分散酶组于注射后第4周进行终点检测；基质胶联合RPE细胞组于RPE细胞注射后第4周(即基质胶注射后第5周)进行终点检测。在终点时间点，于全身麻醉下采集眼底图像，随后处死小鼠并摘取眼球进行HE染色和免疫荧光染色。

1.5 眼底照相和OCT检查

       造模4周后，对小鼠进行麻醉和散瞳，采用小动物眼底成像系统进行眼底照相和OCT检查，观察玻璃体混浊、纤维增殖膜形成、视网膜牵拉、褶皱、脱离以及眼内出血和晶状体脱位等情况，并根据病变特征对小鼠PVR严重程度进行分级(表1)^[18]。所有影像均由2名对实验分组未知的研究者独立评价。检查结束后对小鼠实施安乐死并摘除眼球，用于后续病理学检测。

1.6 RPE细胞处理

       在动物实验开始前2天，将RPE细胞传代接种至合适密度。实验前消化细胞，终止消化后用PBS洗涤并进行细胞计数，将细胞密度调整为1×10⁴个/µL。制备好的细胞置于冰上保存，并于1 h内完成眼内注射操作。

1.7 HE染色

       小鼠眼球用4%多聚甲醛(158127，Sigma)室温固定2 h，修剪眼球外筋膜组织。依次经梯度乙醇脱水(70%、80%、90%、95%、100%，各40 min)，透明(依次浸泡于三缸二甲苯中，每次1 h)和浸蜡(依次浸泡于三缸石蜡中，每次1 h)，将组织包埋于石蜡中。在石蜡切片机上将眼球切成5 μm厚的切片。切片脱蜡和水化后，进行苏木素-伊红染色，染色后将切片脱水、透明，晾干，用中性树胶封片。在显微镜下采集图像，用ImageJ(1.52a，USA)对图像进行分析。

1.8 免疫荧光染色

       将小鼠眼球置于4% PFA中室温固定2 h，PBS洗涤3次后，解剖去除眼球外筋膜组织、角膜和晶状体。随后用蔗糖溶液进行梯度脱水(10%、20%和30%蔗糖各1 h，至眼球沉底)，OCT包埋试剂包埋，冷冻切片机制成10 μm厚切片。切片用含5%驴血清(D9663，Sigma)和0.5% Triton X-100的封闭液封闭1 h，加入Fibronectin一抗(1∶500)4 ℃孵育过夜。次日洗涤后加入相应二抗，室温避光孵育1 h，DAPI染细胞核。利用共聚焦显微镜或倒置荧光显微镜对染色组织进行拍照，使用ImageJ软件对图片中的Fibronectin阳性染色区域进行统计分析。

1.9 统计学处理

       图片定量测量使用ImageJ软件，统计分析采用GraphPad Prism 9软件。结果以均数±标准差表示，以P<0.05为差异有统计学意义。两组间比较采用Welch校正t检验；多组间比较采用单因素方差分析，当数据服从正态分布且方差齐时，采用标准ANOVA法，当方差不齐时，采用Welch ANOVA。PVR评级分析采用Kruskal-Wallis检验。

2. 结果

2.1 基质胶联合RPE细胞模型诱导PVR病变且视网膜损伤更轻

       本研究进行了5组PVR造模。结果显示，与对照组(图1A)相比，分散酶组视网膜层次结构明显紊乱。除出现明显的视网膜前膜(红色三角)外，还可观察到明显的视网膜脱离(蓝色三角)、视网膜萎缩(红色星号)以及眼内出血(白色星号)，提示分散酶在诱导PVR的同时也造成了较严重的视网膜组织损伤(图1B、F)。单独注射RPE细胞组主要引起视网膜上膜形成(红色三角)，病变范围较小，典型膜样组织形成有限(图1C、F)。单独注射基质胶组主要形成视网膜下膜(橙色三角)和视网膜浅脱离(蓝色三角)(图1D)。基质胶联合RPE细胞组则诱导出了典型的PVR病变，包括视网膜脱离(蓝色三角)、视网膜前膜和下膜(红色和橙色三角)。更重要的是，与常用的分散酶组相比，该模型引起的视网膜损伤较为轻微，未出现明显的视网膜萎缩或出血现象(图1E、F)。

(A)对照组；(B)分散酶组；(C)RPE细胞组；(D)基质胶组；(E)基质胶联合RPE细胞组。比例尺：100 μm。黑线：OCT对应的眼底区域；蓝色三角：视网膜脱离；白色星星：眼内出血；红色星星：视网膜萎缩；红色三角：视网膜前膜；橙色三角：视网膜下膜。(F)不同组PVR分级的统计。n=5，*P<0.05，***P<0.001，ns表示无统计学意义。

(A) Control group; (B) Dispase group; (C) RPE cell group; (D) Matrigel group; (E) Matrigel combined with RPE cells group. Scale bar: 100 μm. Black line: fundus area corresponding to OCT; blue arrow: retinal detachment; white asterisk: intraocular hemorrhage; red asterisk: retinal atrophy; red arrow: epiretinal membrane; orange arrow: subretinal membrane. (F) Statistical analysis of PVR grading in each group. n=5; *P<0.05, ***P<0.001, ns, not significant.

2.2 基质胶联合RPE细胞模型能形成视网膜前膜和视网膜下膜

       HE染色显示，与对照组相比，分散酶组出现明显的增殖膜形成和视网膜脱离(图2A)。然而，该模型伴有广泛的视网膜结构破坏和萎缩(图2A~C)，因此难以判断这些病理改变是源于PVR相关的纤维增殖过程，还是分散酶造成的直接组织损伤。RPE细胞组在视网膜上方形成局部的纤维增殖膜(图2A、B)，但视网膜下膜形成不明显(图2A、C)。基质胶组主要在注射区域形成局部的视网膜浅脱离及少量细胞聚集，膜性结构形成不明显(图2A~C)。基质胶联合RPE细胞组可观察到明显的视网膜前膜和下膜形成，并伴有视网膜皱褶和局部脱离(图2A~C)。在上述5个组中，仅分散酶组和基质胶联合RPE细胞组均能形成典型的视网膜前膜和下膜，并诱导视网膜脱离。与分散酶模型相比，基质胶联合RPE细胞组能在较完整保留视网膜组织结构的同时，稳定再现PVR的膜性增殖表型，且组内一致性更好。

(A)各组眼球组织的HE染色代表图，包括低倍全景图及方框区域的局部放大图。比例尺：全图100 μm；局部放大图30 μm。红色箭头：视网膜前膜；橙色箭头：视网膜下膜；蓝色箭头：视网膜脱离；红色星号：视网膜萎缩。(B-C)不同组间视网膜前膜与视网膜下膜的统计学分析；n=5；**P<0.01，***P<0.001，ns表示无统计学意义。

(A) Representative hematoxylin-eosin-stained sections in each group, including low-magnification images and higher-magnification images of the boxed areas. Scale bars: 100 μm. Red arrow: epiretinal membrane; orange arrow: subretinal membrane; blue arrow: retinal detachment; red asterisk: retinal atrophy. (B, C) Statistical analysis of epiretinal membranes and subretinal membranes in each group. n = 5; ** P < 0.01; *** P < 0.001, ns: no significance.

2.3 基质胶联合RPE细胞模型形成定位明确的纤连蛋白阳性增殖膜

       为评价PVR模型中纤维增殖膜的病理特征，本研究对基质胶联合RPE细胞组及分散酶组进行Fibronectin(纤维化标记物)免疫荧光染色。结果显示，两组病变区域均可见明显的Fibronectin阳性膜样结构，整体染色强度未见明显差异(图3A、B)。然而，两组Fibronectin阳性结构的空间分布和周围视网膜形态存在明显差别。分散酶组伴有严重的视网膜皱褶及层次紊乱，部分Fibronectin阳性膜样组织已与视网膜上方或下方区域失去明确的解剖对应关系。相比之下，基质胶联合RPE细胞组的眼球形态和视网膜层次结构保持相对完整，Fibronectin阳性膜样结构主要分布在视网膜前部和下部区域，与视网膜之间的解剖关系清晰，且视网膜层内异常的Fibronectin沉积较少(图3A、B)。上述结果表明，尽管两种模型均能形成具有纤维化特征的增殖膜，但基质胶联合RPE细胞模型对视网膜组织的非特异性损伤较轻，增殖膜定位更明确，更有利于观察和评价PVR的进展。

(A, B)基质胶联合RPE细胞组和分散酶组眼球切片的Fibronectin免疫荧光染色。绿色：Fibronectin；蓝色：DAPI。比例尺：500 μm。红色箭头：Fibronectin⁺纤维增殖膜。(C) Fibronectin⁺染色区域/视网膜对应DAPI染色区域；n=8；ns表示无统计学意义。

(A, B) Immunofluorescence staining for fibronectin in the Matrigel + RPE cell and dispase groups. Green: fibronectin; blue: DAPI. Scale bar: 500 μm. Red arrow: fibronectin-positive membrane. (C) Statistical analysis of fibronectin-positive staining; n = 8; ns: no significance.

3. 讨论

       目前尚无疗效确切的药物能逆转已形成的PVR增殖膜，治疗仍以玻璃体切除、增殖膜剥除、视网膜切开或切除以及眼内填充等手术方式为主。然而，PVR增殖膜常与视网膜组织紧密粘连，增加了膜剥除和视网膜复位的手术难度^[19]；对于严重病例，术中可能需要联合视网膜切开或切除，存在视网膜裂孔、出血及视网膜组织损伤等风险^[20]。同时，手术主要针对已形成的增殖膜和视网膜牵拉，难以从根本上阻断持续存在的炎症反应、细胞迁移及纤维化过程，因此术后仍存在增殖膜再形成和视网膜再次脱离的风险，该类患者往往需要多次手术却难以获得理想效果^[21]。因此，亟需深入阐明PVR的发生发展机制并探索有效的药物干预策略。

       建立能够贴近PVR主要病理过程的动物模型，是解析其病理机制和评估潜在治疗方法的重要基础。理想的PVR动物模型不仅应具备视网膜前膜和视网膜下膜等具有纤维化特征的重要形态学改变，还应避免过度的非特异性组织损伤。本研究通过眼底照相、OCT和HE染色分析，旨在筛选能够更贴近临床PVR主要病理特征的小鼠模型。结果显示，单独注射RPE细胞或基质胶仅引起局限性纤维增殖膜形成或视网膜脱离，在增殖膜的形成和发展方面缺乏稳定性和一致性；分散酶注射操作虽相对简单，可诱导形成典型的视网膜周围纤维增殖膜及视网膜脱离，但由于其对胶原组织的破坏^[22]，会导致视网膜萎缩、出血和晶状体脱位等并发症，对视网膜结构破坏较严重，阻碍了对PVR的观察。相比之下，基质胶联合RPE细胞组在不明显破坏视网膜基本形态的基础上，诱导出了典型的视网膜前膜和视网膜下膜形成以及对应区域的Fibronectin沉积，这些膜样物收缩引起牵拉性视网膜脱离，能较完整地模拟临床PVR膜形成、细胞外基质沉积和视网膜牵拉的主要病理表型。

       RPE细胞是PVR增殖膜的重要效应细胞^[1,23]，但单独将细胞悬液注射至玻璃体腔后容易扩散，且可能因缺乏黏附基质而难以稳定存活和成膜^[13]。基质胶含有层粘连蛋白、Ⅳ型胶原及多种基底膜相关成分^[24]。单独注射基质胶虽可形成团块样结构，但因缺少持续参与增殖和组织重塑的细胞成分，不能形成典型的纤维增殖膜。两者联合应用时，基质胶可为RPE细胞提供局部三维支架，促进其眼内滞留、聚集及细胞外基质沉积^[25]，从而形成视网膜前及视网膜下增殖膜。Fibronectin是纤维化细胞外基质的重要组成成分，参与细胞黏附、迁移和组织重塑^[26]。本研究发现，基质胶联合RPE细胞模型所形成的膜样组织具有明显的Fibronectin沉积，表明该组织并非单纯由外源凝胶构成，而是具有纤维化和基质重塑特征。与依赖蛋白水解损伤的分散酶模型相比，该模型可能更适合用于PVR发病机制及抗纤维化干预研究。

       本研究存在一定局限性。首先，本研究主要通过眼底照相、OCT和组织学观察评价模型，尚缺乏视网膜电流图、视觉诱发电位等功能评估以反映小鼠视力损害程度。其次，基质胶为成分较复杂的生物基质，其与RPE的协同作用机制及最佳诱导组合仍需阐明，未来需优化RPE细胞数量和基质胶浓度等条件。此外，由于不同模型采用的诱导方式(注射部位、注射次数及诱导因素)存在差异，各模型间的比较主要基于终点时的病理表型，不能完全排除不同诱导条件对疾病进展速度和严重程度的影响。

       综上，基质胶联合RPE细胞建立的小鼠PVR模型能够诱导出典型的视网膜前膜和视网膜下膜，并呈现明显的Fibronectin沉积、视网膜皱褶及局部视网膜脱离。与单独注射RPE细胞或基质胶相比，该模型的纤维增殖表型更为典型；与分散酶模型相比，其非特异性视网膜组织损伤相对较轻，模型一致性更强。该模型可为PVR发病机制研究和候选治疗策略的体内评价提供有价值的实验工具。

声明

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利益冲突

所有作者均声明不存在利益冲突。

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