文章亮点
1. 关键发现
• 环保试剂在眼科标本组织中脱水、染色应用效果良好，可满足病理日常制片和染色需求，且全流程无二甲苯，具有环保优点，成本可控。2. 已知与发现
• 病理科广泛使用传统试剂制片、染色，二甲苯作为首选组织透明剂和脱蜡剂，具有致癌致畸危害。环保试剂作为新型脱水透明试剂，在眼科标本组织中尚未见报道和使用。本文探讨了环保试剂在眼科组织中的使用效果，与传统试剂比较无显著性差异，具有环保优点，成本可控，值得推广应用。3. 意义与改变
• 应用环保试剂可替代传统试剂用于眼科标本组织的脱水、染色，减少对病理工作人员身体健康的危害，优化了病理科工作环境。福尔马林固定、乙醇脱水、二甲苯透明是传统病理技术中处理组织的方法[1]。其方法之经典，以及良好的效果使之从十九世纪创立以来一直沿用至今，但其对环境和健康的危害一直存在。随着科技的创新、以人为本理念的推广，环保试剂替代有危害的传统试剂得到了广泛的认可[2-3]。但一方面出于成本的压力，一方面各公司环保试剂品牌众多，病理工作者需要摸索和实践环保试剂在病理科的应用以达到稳定效果。笔者发现许多三甲医院因为制片效果不如意，仍然使用传统试剂，因此实际应用中环保试剂的使用并未普及，尤其在眼科标本组织处理中未见相关报道。
眼球组织结构特殊，外层巩膜是致密结缔组织，内层视网膜柔软、易剥离脱落，球内有较硬的晶状体和透明胶状物构成的玻璃体[4-5]。因其各层组织细胞成分的差异和质地软硬不一，选择合适的组织脱水试剂对于制片尤为重要，否则容易导致眼球皱缩、眼内结构紊乱、视网膜脱离等问题[5-6]，难以做出一张优秀的结构完整的眼球切片。
文献报道，新型环保试剂在我国北方如首都医科大学附属北京妇产医院等有较好的使用经验[7-8]，但在南方城市报道少，未见普及使用[9]。鉴于眼科标本的独特性以及温湿度对于组织脱水的影响，本研究拟探讨新型环保试剂在南方地区医院眼科标本中的使用效果。
1 材料与方法
1.1 材料
选取我院2023年6月—2024年3月送检临床病理科手术标本200 例，包括角膜80例、眼内容物(眼内容物剜除术后的送检组织，角巩膜、脉络膜、虹膜、睫状体、晶状体等)及眼肿物组织(角膜皮样瘤、结膜乳头状瘤、多形性腺瘤、眼眶孤立性纤维瘤、脂肪瘤、淋巴瘤等)100例、眼球20例。同一位置取材分成2份，一份使用传统试剂，中性福尔马林固定、梯度乙醇脱水、二甲苯透明；另一份使用环保试剂套装。排除组织较小不满足取材要求的标本10例，最终纳入190例标本。传统试剂组为对照组，环保试剂组为实验组。将来自同一组织的两组病理标本脱水、染色进行对比。本研究获得中山大学中山眼科中心医学伦理委员会批准(批件号2025KYPJ022)。1.2 试剂与仪器
1.2.1 主要试剂传统试剂组(对照组)组织固定、脱水、透明试剂包括中性福尔马林、乙醇、二甲苯；苏木精-伊红(hematoxylin-eosin, HE)染色脱蜡、透明试剂为二甲苯。二甲苯、乙醇购自广州市中南化工仪器有限公司。中性福尔马林、苏木素、伊红购自广州维格斯生物科技有限公司。封片为普通中性树脂，由北京益利精细化学品有限公司生产。
环保试剂组(实验组)组织样本制备套装包括组织固定液(10%中性缓冲福尔马林)、组织样本制备脱水液、组织样本制备透明液(无苯)、清洗液；产品编号BLE01-04 。HE染色使用环保脱蜡液、环保透明液；封片为无苯封片胶，均由北京九州柏林生物科技有限公司生产。
包埋所用石蜡均为徕卡进口石蜡。免疫组织化学染色所用一抗CD3等购自福州迈新生物科技有限公司。免疫组化二抗试剂盒购自罗氏诊断产品(上海)有限公司。
1.2.2 主要仪器
徕卡脱水机ASP200、赛默飞HistoStar组织包埋机、赛默飞半自动轮转切片机和流水系统(HM340E+ STS)、察微E7全自动染色封片一体机、日本Olympus光学显微镜(BX53)。罗氏BenchMark Ultra全自动免疫组化机。
1.3 方法
1.3.1 脱水、染色所有组织中一组采用传统试剂进行组织脱水、染色；一组采用环保试剂进行脱水、染色。2组标本无明显差异，脱水程序时间设置见表1。制成蜡块后均制作2张 4 μm切片，分别进行常规HE染色及免疫组化染色。HE染色步骤：切片70 ℃烤片20 min后脱蜡15 min；无水乙醇、95%乙醇各2 min，自来水水化1 min; 苏木精染色7 min，自来水洗1 min；1%盐酸乙醇分化液分化2 s，自来水返蓝5 min；伊红染色2 min；80%、95%、无水乙醇各1 min；透明液透明2 min，封片。免疫组化步骤：切片经烤片后置于罗氏Bench Mark Ultra全自动免疫组织化学平台，按各抗体预设的程序进行染色，EZ prep液脱蜡处理后，进行合适的抗原修复(CD3抗体采用CC1修复液修复32 min)，3% H2O2封闭内源性过氧化物酶，一抗、二抗孵育，DAB(3, 3'-二氨基联苯胺)或AP(碱性磷酸酶)显色，苏木素复染，返蓝，程序结束取片，封片。
表 1 两组脱水流程设置比较
Table 1 Comparison of dehydration process settings between two groups
|
对照组（传统试剂） |
时间 |
实验组（环保试剂） |
时间 |
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10％中性福尔马林 |
1 h |
环保固定液1 |
1 h |
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80%乙醇 |
90 min |
环保固定液2 |
30 min |
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95%乙醇 |
90 min |
75%乙醇 |
90 min |
|
95%乙醇 |
90 min |
环保脱水液1 |
90 min |
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100%乙醇 |
1 h |
环保脱水液2 |
90 min |
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100%乙醇 |
1 h |
环保脱水液3 |
1 h |
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100%乙醇 |
1 h |
环保脱水液4 |
1 h |
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二甲苯1 |
1 h |
环保脱水液5 |
30 min |
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二甲苯2 |
1 h |
环保透明液1 |
1 h |
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二甲苯3 |
1 h |
环保透明液2 |
1 h |
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58 ℃石蜡1 |
1 h |
58℃石蜡1 |
1 h |
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58 ℃石蜡2 |
1 h |
58℃石蜡2 |
1 h |
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58 ℃石蜡3 |
1 h |
58℃石蜡3 |
1 h |
HE染色质量从细胞结构是否清晰(2分)，颜色是否鲜艳(2分)，对比是否分明(2分)，细胞有无皱缩(2分)，透明度是否良好(2分)来评价传统试剂与环保试剂处理的HE染色切片的染色质量[10]。评价结果分为优(9 ~ 10 分)，良(7 ~ 8 分)，差(≤6 分)3 个等级。
1.3.3 免疫组化染色结果判读[11]
阳性物质呈棕色或红色，细胞核呈蓝色。不同的抗原，其定位按说明书分别定位在细胞膜、细胞核或细胞质上。
1.4 阅片
由本科室2名经验丰富的病理医师采用双盲法进行阅片，按上述评分标准评价图片质量。1.5 统计学分析
采用SPSS26.0软件进行统计学分析，等级资料组间比较采用秩和检验，以P < 0.05为差异有统计学意义。2 结果
2.1 两组脱水、切片效果比较
两组蜡块脱水良好，切片软硬适中，能连续切片，厚薄均匀。组织切面完整，无裂隙及颤痕。见图1、2。图1 两组脱水效果比较
Figure 1 Comparison of dehydration effects between two groups
The corneal, dermolipoma, eyelid xanthoma, endophthalmitis lesions, orbital solitary fibrous tumor, orbital melanoma, eviscerated ocular contents, and choroidal melanoma tissue samples were well-dehydrated and had appropriate hardness after treatment with conventional reagents and environmentally-sustainable reagents.
图2 两组切片效果比较
Figure 2 Comparison of sectioning effects between two groups
The eye tissue sections prepared with conventional reagents and environmentally-sustainable reagents are intact, structurally clear, and exhibit excellent sectioning quality.
2.2 两组HE染色质量评价比较
传统试剂组和环保试剂组优良片率分别为98.4%、97.9%，各级片率比较差异无统计学意义(Z = –0.645，P = 0.519)。见表2。表 2 两组苏木精 - 伊红 (HE) 染色质量评价比较
Table 2 Comparison of HE staining quality assessment between two groups
2.3 两组HE染色结果图
传统试剂组及环保试剂组进行常规HE染色的切片，镜下观察角膜、脂肪组织、肿瘤组织、葡萄膜组织等结构完整，细胞结构清晰，染色鲜艳，核质对比明显，染色效果无明显差异。见图 1~7。图3 角膜 HE染色，×200
Figure 3 Cornea, HE staining, ×200
图4 脂肪组织 HE染色，×200
Figure 4 Adipose tissue, HE staining, ×200
图5 孤立性纤维肿瘤 HE染色，×200
Figure 5 Solitary fibrous tumor, HE staining, ×200
图6 眼眶多形性腺瘤 HE染色，×200
Figure 6 Lacrimal gland pleomorphic adenoma, HE staining, ×200
图7 葡萄膜组织 HE染色，×200
Figure 7 Uveal tissue, HE staining, ×200
图8 淋巴瘤组织CD3 免疫组化，×200
Figure 8 CD3 immunohistochemical in lymphoma tissue, ×200
2.4 两组免疫组化结果图
经环保试剂处理的组织抗原性完好，阳性信号强、定位准确，无背景染色、无组织掉片。见图8。3 讨论
长期以来病理科广泛使用传统试剂制片、染色，二甲苯作为首选组织透明剂和脱蜡剂，渗透均匀、稳定，作用快速温和，组织处理软硬适中，且不易导致组织过度收缩、过硬现象[12]。但二甲苯已经被世界卫生组织确定为致癌和致畸物质，病理工作者们一直期待寻找到一种合适的环保替代品。市场上以环保试剂为“噱头”的产品许多，但价格较于传统试剂仍过高，效果不佳，因此均未得到推广应用，导致国内许多医院不得不依然使用传统试剂进行HE染色[13]。眼球标本制片有其独特之处，眼球组织各部分软硬度不同，液体也不易渗透眼球壁，组织处理过程中要防止组织收缩、变脆变硬、视网膜脱离等问题[14]。本科室经过数年试用摸索，使用组织样本制备套装环保试剂替代二甲苯等传统试剂，经过对照实验，发现两者效果相当，值得推广。3.1 环保试剂与传统试剂比较的效果与优势
本研究中使用的环保试剂是一种以醇类为主、低毒、化学结构稳定的混合物，不含二甲苯。脱水液包括叔丁醇、异丙醇、丙酮等与水互溶的有机溶剂。其中，叔丁醇是无毒的，不易使组织收缩硬化；异丙醇，脱水能力比乙醇强；四氯乙烯，能快速脱水，具有固定兼脱水的作用，对组织收缩的影响小；丙酮，能快速脱水并兼有固定作用。透明液包括仲丁醇、D-柠檬烯、环己烷，清洗液包含D40溶剂油等。仲丁醇具有良好的溶脂作用；D-柠檬烯是一种天然成分，常用作清洗剂；环己烷的折射率(1.42)与二甲苯(折射率1.5)相近，不易引起收缩变形或组织硬化。它们均为与脱水液互溶又能溶解石蜡的有机溶剂，且挥发性比二甲苯小，低毒、无刺激。D40溶剂油具有良好的溶解力和低毒性，是一种应用广泛的环保型溶剂油，能彻底清洗脱水机工作缸和管路。另外，无苯封片胶封片后切片无异味、透明度高，加之与全自动脱水机、染色封片工作站配合使用，全流程无苯化、安全环保，也有利于染色的质量控制。与传统试剂组相比，环保试剂组在HE染色镜下可见细胞核结构清晰、核质对比鲜明、背景干净，两者优良差各级片并无明显差异(Z = –0.645，P = 0.519)，因此能够保证日常HE染色质量。同时研究显示不影响后续染色结果在特殊染色[15]、免疫组化(图8)、荧光原位杂交[16]等检测中，均有稳定的表现。
3.2 染色过程中遇到的问题及处理对策
眼眶淋巴瘤组织细胞较丰富，容易出现干和硬的现象，往往是因为固定不充分，组织内有水、与高温下的石蜡不相融，组织被“干烤”导致发硬发脆[17-18]。此时应检查固定是否充分，脱水要彻底。我们也推测因为脱水剂中含有少量的丙酮，组织过度收缩，也会导致组织一定程度发硬发脆。眼眶皮样脂肪瘤等组织因含脂肪等疏松结缔组织，若脱水不足，浸蜡不充分，蜡块会出现白色云雾状，无法切出完整切片。角膜、巩膜组织比较致密坚韧，若固定或脱水不足，会导致局部组织发白，不易制片，且做后续免疫组化时容易掉片。因此，标本前处理很重要，注意固定充分，脱水彻底，有必要时加强检查固定，并及时更换脱水试剂，保证脱水质量。3.3 成本控制的平替方案
许多新型环保试剂推出后，由于成本制约，在国内许多医院未能大规模应用[19]。我们结合环保试剂特点，找到一种平替方案来节省成本。具体方法是，将前面环保脱水液改用常规的梯度乙醇，仅在最后一道使用环保试剂套装的环保脱水液，环保固定液1、2也由市售中性福尔马林替代，从而减少了环保试剂更换带来的成本负担，而且脱水效果不受影响[20]。综上所述，环保试剂套装处理技术给病理科室带来健康、环保、优质、高效的工作环境，值得广大病理医师、组织机构推广使用。