原位癌，又称 Bowen 氏病，或上皮内上皮癌。多见于老年人，好发于角结膜交界处，为单眼发病的一种缓慢生长的交界性肿瘤[1]。其癌细胞仅局限于上皮层，不破坏上皮基底膜，完整而清晰的基底膜是本病的诊断要点。而 HE 染色常无法清楚显示基底膜，导致无法判断肿瘤细胞是否已经侵犯破坏基底膜，需通过特殊染色来确定基底膜是否完整。
文献 [2-4] 中报道的有关基底膜的染色方法主要有糖原染色的过碘酸-Schiff 法（Periodic AcidSchiff，PAS）和霉菌染色的银浸染法，如六亚甲基四胺银法（Grocott Methenamine silver，GMS）、Gomori 氏氢氧化银氨法（Gomori）。田澄等[5]观察微波辐射 PAS 染色法显示声带鳞状细胞癌早期基底膜改变，为正确判断瘤细胞有无突破基底膜提供了依据；戚晓东[6]采用过碘酸六铵银染色法显示肾小球基底膜；Pujar 等[7]比较了PAS和荧光吖啶黄 PAS 观察口腔扁平苔藓中基底膜状态。有关角结膜原位癌基底膜染色的研究尚未见报道。
本文分别采用 PAS 染色法、 GMS 染色法、Gomori 染色法观察角结膜原位癌基底膜状态，比较这三种染色着色情况并分析，旨在为角结膜原位癌找到一种简单、高效的基底膜染色法。
1 材料与方法
1.1 材料
收集中山大学中山眼科中心 2012 年 1 月 至 2017 年 9 月期间，经两名病理医师确诊的 20 例角结膜原位癌的标本。其中男 10 例，女 10 例。年龄 42~86（平均 61.5）岁。发生于角膜 4 例，结膜 6 例，角结膜 10 例。标本经 10% 甲醛溶液固定，常规脱水、透明、石蜡包埋。每例标本连续切片 8 张，厚度 3 μm，随机分为四组，每组两张：1）常规 HE 染色组；2）PAS 染色组；3）GMS 染色组；4）Gomori 染色组。本文研究中涉及的人体组织标本获得中山眼科中心医学伦理委员会审批。
1.2 试剂配制
参照梁英杰等编著《临床病理学技术》[8]，1）PAS 染色主要试剂：① 0.5% 过碘酸水溶液：过碘酸 0.5 g，蒸馏水加至 100 mL。②无色品红液：碱性品红 1 g，加入 200 mL 煮沸的蒸馏水中完全溶解，冷却至 50℃，加入 1 mol/L 盐酸 20 mL，待溶液冷至 25℃ 左右，加入偏重亚硫酸 1.5 g，于室温暗处 24 h，加入活性碳 1.5 g，静置 1~2 h。双层滤纸过滤到小口砂塞瓶内，此时溶液应完全无色，即为无色品红，又称 Schiff 氏液。2）GMS 染色主要试剂：① 8% 铬酸水溶液。铬酸 8 g，蒸馏水加至 100 mL。②六胺银贮备液。将 3% 六次甲基四胺溶液 50 mL，加入 2.5 mL 5% 硝酸银溶液即形成白色沉淀，摇动立即溶解。③六胺银工作液。取 1.6 mL的 5% 四硼酸钠溶液，加入 8 mL 的六胺银贮备液中，最后加入蒸馏水 20 mL。3）Gomori 染色主要试剂：① Gomori 银氨液。10% 硝酸银 3 mL，加入 10% 氢氧化钾 1 mL，即发生棕黑色颗粒沉淀，观察此溶液的总量并记下，加入约 10 倍以上的蒸馏水洗涤沉淀物，倾去上层清液，再加入蒸馏水，如此反复洗涤 3 次，最后加蒸馏水凑足原来记下的总量。逐滴滴入氢氧化铵，并不断轻轻震荡，直至沉淀物完全溶解。再一次加入 10% 硝酸银数滴至溶液稍变混浊，再小心加入氢氧化铵 1 滴至数滴，使溶液恰又变清。最后按原总量加蒸馏水 10 倍稀释，用棕色瓶保存于 4℃ 冰箱，用前取出恢复到室温。② 0.5% KMnO4 溶液。③ 2% 草酸溶液。④ 2.5% 铁明矾溶液。⑤ 10% 甲醛溶液。
1.3 染色方法
1）常规 HE 染色组。所有切片进行 HE 染色。2）PAS 染色组。切片常规脱蜡至水，蒸馏水润洗。用 0.5% 过碘酸水溶液氧化 10 min。流水冲洗，再用蒸馏水稍洗。滴加无色品红液覆盖组织，于暗处加盖作用 10~20 min。流水冲洗 2 min。常规脱水透明。二甲苯透明。中性树胶封固。3）GMS 染色组。切片常规脱蜡至水，蒸馏水润洗。8% 铬酸水溶液氧化 10 min。蒸馏水稍水洗，置入六胺银工作液，微波炉中低火力 2 min，至切片呈黄褐色。蒸馏水洗。无水酒精脱水。二甲苯透明。中性树胶封固。4） Gomori 染色组。切片常规脱蜡至水，蒸馏水润洗。0.5% KMnO4 水溶液氧化 5 min，水洗，2% 草酸水溶液 1~2 min，至切片漂白即可。水洗，入 2.5% 铁明矾溶液 3 min，蒸馏水冲洗 3 min，氨银溶液浸染 3~5 min。蒸馏水速洗后入 10% 甲醛还原 1 min，为避免染色不均，染色时一直振荡切片。流水冲洗 5~10 min。常规脱水透明，中性树胶封固。
高倍（×100，×200）镜检下观察。比较三种染色方法基底膜显示状态。
2 结果
2.1 常规 HE 染色结果
角结膜原位癌组织病理学上可见上皮细胞大小不等、排列紊乱，核浆比增大，有异型，但基底膜欠清晰（图 1）。
2.2 三种不同基底膜染色方法的结果
PAS 染色角结膜原位癌，基底膜清晰可见，对比明显，无背景色；GMS 染色，角结膜原位癌基底膜呈深棕色而与背景黄棕色反差较小，区分不明显；Gomori 染色法显示角结膜原位癌基底膜呈黑色，对比强烈但是有较多的银颗粒沉积而导致背景着色（图 2，3）。
图 1 角结膜原位癌 HE 染色图
Figure 1 HE staining of cornea and conjunctiva carcinoma in situ
（A）×100 ；（B）×200 。箭头所示为基底膜。
（A）×100; （B）×200. The solid arrows show basement
membranes.
图 2 三种角结膜原位癌基底膜染色图（×100）
Figure 2 Three special staining methods of basement membranes in cornea and conjunctiva carcinoma in situ （× 100）
（A）PAS 染色；（B）GMS 染色；（C）Gomori 染色。箭头所示为基底膜。
（A） PAS staining; （B） GMS
staining; （C） Gomori staining. The solid arrows show basement
membranes.
（A）PAS 染色；（B）GMS 染色；（C）Gomori 染色。箭头所示为基底膜。
（A）PAS staining; （B）GMS staining; （C）Gomori staining. The solid arrows show basement membranes.
3 讨论
原位癌，是一种复发率高的皮肤癌，可发生在身体各个部位，以头面部及颈肩部等暴露部位常见[9-10]。病理特点为原位癌肿瘤只局限于上皮层内，未突破基底膜，染色见基底膜完整；而原位癌早期浸润，突破基底膜，染色见基底膜断裂缺失。常规病理切片 HE 染色显示基底膜着色不明显，镜下观察困难且容易误诊。因此寻找好的特殊染色方法鉴别基底膜形态的完整性具有重要的意义。
本文通过比较 PAS、GMS、Gomori 三种特殊染色方法，发现 PAS 染色法优于其他两种方法：
1）GMS 染色角结膜原位癌基底膜呈深棕色而与背景黄棕色反差较小；Gomori 染色虽基底膜显黑色较明显，但是有较多银颗粒沉积的背景色。Gomori 染色原理是通过染液中银离子与基底膜的糖蛋白结合，前者经甲醛醛基还原为金属银，银离子沉积于基底膜而呈黑色，从而使基底膜显示出来。而氨银液很敏感，受光或空气中氧的作用后均易解离出银盐而导致银颗粒沉积，产生背景。
2）在应用 GMS 和 Gomori 染色时发现：若染色过程中不注意染色细节，极易造成组织切片染色效果不佳。对玻璃器皿要特别注意洁净，如有杂质容易产生沉淀，导致背景污浊；总体不如 PAS 染色直观、容易操作。
因此观察角结膜原位癌基底膜，PAS 染色为首选方法。染色结果较满意，上皮细胞与基底膜形态学间相互关系一目了然，有利于直观判断与比较。
PAS 染色方法常用来显示糖原、黏蛋白、真菌等物质，在显示角结膜原位癌基底膜染色中，PAS 染色有以下几个方面需注意：
1）高碘酸氧化时间一般为 10 min，若周围环境温度低于常温，应适当延长氧化时间；反之周围环境温度高，适当缩短氧化时间。此步骤是 PAS 染色的关键步骤，利用高碘酸的氧化功能，充分氧化糖类及有关物质中的 1,2-二醇基转为醛类，醛与 Schiff 氏液结合生成品红色复合物而显色。因此，氧化程度的好坏直接影响染色效果。
2）Schiff 氏液使用前应注意是否无色，是否有刺激性气味。正常 Schiff 氏液无色透明、含二氧化硫刺激性气味，如果颜色变红、刺激性气味消失，可加入少量偏重亚硫酸钠或数滴亚硫酰二氧。在 Schiff 氏液染片过程中，应加盖以防二氧化硫气体挥发。染色时间方面，一般为 10 min，若 Schiff 氏液试剂新鲜配制或储存时间短，二氧化硫浓度高，染色时间适当缩短 5 min。此步染色时间的掌握比较重要，不宜过长或过短。若染色时间短，则糖原未能表达出来，或着色过浅，影响基底膜的观察。过长则除糖原着色外，间质也将着色，基底膜染色与背景区分不明显，影响对比度，不利于观察。笔者认为只要肉眼观察组织切片出现轻微的淡红色即可终止 Schiff 染色。
综上所述，比较 PAS、GMS、Gomori 三种染色方法中，在显示角结膜原位癌基底膜状态方面，PAS 是一种相对简单、高效而且显示基底膜效果较好的染色方法。