盖玻片辅助人晶状体上皮细胞原代培养法
阅读量：2183
发布日期：2024-11-05
作者：
彭瑞萍 ,吴明星 ,叶少碧
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关键词
人晶状体上皮细胞
原代培养
白内障
摘要
目的: 建立人晶状体上皮细胞原代培养的简便方法并比较不同来源人晶状体上皮细胞的生物学特性。
方法: 取胎龄 20 周合法引产胚胎眼晶状体囊膜、中山眼科中心眼库眼晶状体囊膜和白内障患者术中撕取的前囊膜, 分别在培养皿中铺平, 加10 μL 10%DMEM 培养液润湿后加盖盖玻
片防止卷曲并促进粘贴, 添加培养液浸没盖玻片, 37℃培养。同时取相同来源的囊膜按照组织块法培养。观察细胞增殖情况并比较原代人晶状体上皮细胞与人晶状体上皮细胞系 SRA01/04 β晶体蛋白的表达差异。
结果: 在盖玻片辅助下, 胚胎眼晶状体囊膜第2天即可见明显的增殖细胞由囊膜缘长出, 眼库眼囊膜和白内障患者术中撕取的囊膜在3～4 d 的潜伏期后亦可见增殖细胞长出; 组织块法培养出现部分组织块漂浮, 且胚胎眼囊膜潜伏期延长至3～4 d, 眼库眼囊膜和白内障患者晶状体囊膜潜伏期延长至4～5 d。
结论: 盖玻片辅助的改良组织块培养法能尽快获得体外培养的原代晶状体上皮细胞, 且操作简便, 值得推广应用于晶状体病的研究。
全文
晶状体是屈光间质中重要组成部分,而晶状体上皮细胞对维持其透明性发挥着重要作用。已有研究表明, 晶状体上皮细胞 (Lens epithelial cell, LEC) 的凋亡是非遗传性白内障发生发展的病理基础[1]。 而后发性白内障 (Posterior capsule opacification, PCO) 也是晶状体上皮细胞过度增殖,向晶状体后囊膜迁移并过度化生的结果。因此, 研究LEC 生物学特性及其在各种环境变化下的功能状态是晶状体病学研究中的重要基本研究手段。成功培养 LEC 对观察细胞分化、研究各种类型白内障形成机制和后发性白内障及药物防治及筛选都有十分重要的价值。晶状体上皮细胞的来源主要有原代培养的人或动物的晶状体上皮细胞和永生化的细胞系。原代细胞的组织来源主要有眼库眼、胎龄 5 周以上合法引产的胎儿、先天性白内障或年龄相关性白内障患者术中取出的晶状体前囊膜。用于研究的永生化的人晶状体上皮细胞系有HLE-B3、HLE-B4、SRA01 /04、FHL124 细胞和永生化的鼠晶状体上皮细胞系 α-NT1、α-NT2、α-NT4, 另外还有永生化的兔晶状体上皮细胞系N/N1003A 等。其中 SRA01/04细胞系是由 Ruddy 实验室于 1998 年用带有大移植抗原 DNA 片段的 SV40(simian virus 40) 转染体外培养的婴儿晶状体上皮细胞得到[2], 目前使用较为广泛 。 HLE-B3, HLE-B4细胞是由 Andley 等用Adeno12-simian virus 40 (Ad12-SV40) 杂交病毒转染婴儿晶状体上皮细胞得到[3]。两种细胞系在建立初期, 都通过 western blotting 检测到 β H 和 γ 晶状体蛋白的表达, 在一定程度上满足了实验大样本的需要。
细胞系的建立为基础研究提供了充足的研究对象, 但用 SV-40 转染的永生化的细胞系在生物学行为和基因表达水平上和原代的晶状体上皮细胞毕竟存在一定差异, 有研究表明随着代数的增加其晶状体蛋白的表达量逐渐降低[3] , 有失去LEC生物学特性的可能, 其研究结果究竟能不能完全反映生理、病理情况下晶状体上皮细胞在白内障和后发性白内障的细胞水平的机制尚不能确定。所以, 进行原代晶状体细胞培养在晶状体病的研究中是十分必要的。
我们对传统的组织块法进行了改良, 减少了机械性刺激对细胞的损伤, 保留囊膜作为基质, 建立了稳定的晶状体上皮细胞原代培养模型。
材料与方法
1. 材料来源: 晶状体囊膜来自中山大学中山眼科中心眼库眼、中山眼科中心白内障患者以及合法引产大龄胚胎(20 周以上); 人晶状体上皮细胞系 SRA01 /04, 由Tufts 大学商福教授馈赠。
2. 主要试剂: DMEM低糖培养基(Gibco) 、胎牛血清(PPA 公司) 、新生牛血清(Gibco) 、青链霉素(上海生工) 、胰蛋白酶(上海生工) , 兔抗人β晶状体蛋白抗体 (由Tufts 大学商福教授馈赠) ,HRP-羊抗兔抗体(中杉金桥) , GAPDH 抗体(康成生物) , 发光 Marker(cell signal) 。
3. 仪器: 二氧化碳培养箱(Shellab) , 超净工作台 (苏州安泰空气技术有限公司) , 解剖显微镜(Leica) , 相差显微镜(Olympus) 。
4. 眼库眼和胚胎来源晶状体的取材及培养:用含双抗 200 μ/ml 的 PBS 浸泡 30 min, 于显微镜下沿角膜缘后 3.5 mm 环行剪开巩膜, 分离眼前后段。眼库眼的晶状体由悬韧带连于前段, 胚胎眼则由于悬韧带未发育完全且玻璃体血管未退化, 晶状体和玻璃体紧密连接。仔细剪除断悬韧带和玻璃体, 分离出完整的晶状体, 尽量避免损伤赤道部囊膜。PBS 冲洗附着的虹膜色素, 前囊膜面向下置于培养皿中。用撕囊镊和显微无齿镊由后极部 5 ～6 等分撕开囊膜, 近多角星状铺于培养皿中 (图1) , 晶状体皮质和核暴露, 轻轻捧出晶状体皮质与核, 囊膜则平铺于培养皿中。滴加 1 滴培养液湿润, 取盖玻片轻轻盖于其上避免在培养液中卷曲,然后加培养液浸没盖玻片, 置于 37℃ 5%CO2 培养箱中培养。有细胞爬出后囊膜仍贴附牢固, 取出盖玻片继续培养, 此后每 3 d 换液一次。融合后按常规方法消化传代。组织块法按照传统方法剪碎囊膜加少量培养液润湿, 2 h 后加足量培养液, 融合后按常规方法消化传代。
5. 白内障患者前囊膜的取材及培养: 白内障患者 (60 岁以下) 前囊膜在行白内障超声乳化吸除术联合人工晶状体植入术中取出, 置于含双抗的培养液中保存取回。在超净台中用撕囊镊轻轻取出, 置于培养皿中。此时张力作用使得囊膜卷曲, 内面为细胞面。用撕囊镊平铺囊膜, 细胞面向上。取盖玻片轻轻盖于其上使其在培养液中不卷曲, 加培养液浸没盖玻片, 37℃ 5%CO2 培养, 观察传代同上。组织块法按照传统方法培养。
6. SRA01/04 细胞系培养: 按照常规细胞系培养方法培养。
7. 提取蛋白, 用常规 western blotting 检测原代细胞和细胞系β 晶状体蛋白表达差异。
结果
1. 铺片后加盖玻片不会影响培养液与细胞的接触, 并可以有效防止囊膜卷曲, 所以此方法不会出现传统组织块法中接种时间间隔过长使组织表面湿润度不足而影响细胞活性的现象。由于采用的培养皿经过表面活性处理, 细胞基本贴附培养
2. 不同来源的晶状体上皮细胞生长活性不同。胚胎来源的晶状体上皮细胞生长最快, 铺片 2 d 后可见细胞明显活化生长趋势, 部分细胞由囊膜缘爬出, 形成内密外疏的细胞群落, 增殖明显且部分跳跃式生长, 在镜下囊膜4～5 个视野外也可见少量细胞生长。细胞保持上皮细胞形态, 呈多角形或星形, 有小突起。4 d 左右细胞在囊膜周围融合, 呈六边形; 4～5 代后细胞衰老, 体积变大, 增殖逐渐停滞, 表现成纤维细胞形态(图 2) 。
组织块法会因部分囊膜碎片贴附不牢, 加入培养液后出现部分组织块漂浮, 且胚胎眼囊膜潜伏期延长至3～4 d, 眼库眼囊膜和白内障患者晶状体囊膜潜伏期延长至 4～5 d。
眼库眼来源的晶状体上皮细胞铺片在经过3～4 d的潜伏期后可见细胞爬出, 增殖明显, 但生长能力较胚胎来源稍弱, 3 代后细胞变大, 呈现纤维化生形态。年龄相关性白内障病人来源的晶状体上皮细胞生长能力最弱, 4～5 d 可见细胞活化,部分沿囊膜爬出, 胞体较大, 呈椭圆形或梭形(图 3) , 传 1 代后生长即变缓甚至停止, 部分凋亡。
3. 盖玻片辅助法与组织块法培养比较: 盖玻片辅助下因机械作用由囊膜面脱落的晶状体上皮细胞贴壁生长的比例明显高于未用盖玻片组, 前者第 1、2 天即可见部分脱落的细胞在盖玻片辅助下贴壁生长, 而组织块法培养脱落细胞很少贴壁生长。在盖玻片辅助下, 胚胎眼晶状体囊膜第 2 天即可见明显的增殖细胞由囊膜缘长出, 眼库眼囊膜和白内障患者术中撕取的囊膜在3～4 d 的潜伏期后亦可见增殖细胞长出; 组织块法培养出现部分组织块漂浮, 且胚胎眼囊膜潜伏期延长至 3 d,眼库眼囊膜和白内障患者晶状体囊膜潜伏期延长至4～5 d。
4. Western blotting 结果 β晶状体蛋白是晶状体皮质和核中由上皮来源的退化细胞高度表达的蛋白。晶状体蛋白占晶状体全部蛋白的 90%以上, β 晶状体蛋白占晶状体蛋白的 35%[4] 。用晶状体皮质蛋白作为阳性对照 (图 4) , western blotting 检测发现其在原代细胞中有表达, 而在 SRA01/04 细胞系表达为阴性。
图1 完整晶状体囊膜平铺于培养皿中
图2 5个月大胚胎来源人晶状体上皮细胞,
图2 5个月大胚胎来源人晶状体上皮细胞,
a: 第一代, 多角形细胞由囊膜边缘爬出(×40) ; b: 第二代, 增殖分裂相明显(×40) ; c: 第四代, 细胞融合, 六角形或椭圆形(×40)
讨论
最早的晶状体上皮细胞培养的报道见1958年 Mamo 用鸡胚取晶状体上皮细胞进行培养[5] , 培养方法复杂。随后牛、鼠、兔、鸡以及人的晶状体上皮细胞体外培养相继获得成功。与动物 LEC 培养相比, 人的晶状体上皮细胞体外培养由于有足够生长能力的囊膜来源有限, 在实际操作中存在一定的困难。眼库眼是满意的供体来源, 但国内角膜捐献数量少, 材料有限; 合法引产胚胎供体同样来源有限且需排除相关发育异常; 60 岁以上白内障患者 LEC增殖能力很弱, 而先天性白内障患者数量有限。
在眼部各种组织细胞中, 晶状体上皮细胞属于不易培养的细胞[6] , 原因之一是其可传代数少。即便是小儿来源 LEC 最多只能传5～6 代, 就会明显老化或纤维化, 生长缓慢甚至停滞, 典型的表现是细胞呈椭圆形但胞体增大, 或伸出伪足, 向成纤维细胞分化; 年龄相关性白内障患者来源的人晶状体上皮细胞一般只能传1 ～2 代。
目前常用的 LEC 原代培养方法主要是组织块和胰酶消化法。传统的组织块法是将囊膜片剪碎后接种至培养瓶表面, 滴少许培养液待一定时间(通常2～3 h, 有学者主张将培养瓶倒置利于囊膜粘贴) 至其粘贴, 再加培养液培养。贴附时间短则贴附不牢, 加培养液后囊膜易漂浮; 贴附时间过长则晶状体上皮细胞活力降低[7] 。此外, 剪切的机械性刺激可能带来部分晶状体上皮细胞的破坏和与囊膜基质的分离。另一种应用较多的是胰酶消化法[8] , 消化过度会影响 LEC 增殖活力, 消化程度不易掌握。石广森等和白芳等在此基础上对其进行了改良, 分别对兔和人的晶状体上皮细胞进行体外培养[7, 9] 。但是仍存在混杂一定的晶状体皮质的问题, 难以完全分离。
本文应用盖玻片辅助晶状体上皮原代培养方法的优点在于减少了对细胞的机械性刺激, 并且用盖玻片帮助囊膜贴壁, 解决了组织块法难以贴壁的问题。加用盖玻片并不会抑制 LEC 与培养液的接触, 在贴壁牢固后轻轻取出盖玻片也不会影响贴壁细胞的生长状态。保留晶状体囊膜作为基质可以促进上皮细胞的活化, 我们推测其原因可能是囊膜作为细胞的附着基质可能有利于细胞的活化, 囊膜中的细胞外基质 (Extracellular matrix, ECM) 可以促进细胞的增殖。
兔晶状体上皮细胞的体外增殖能力和动物年龄呈负相关, 人类不同年龄晶状体上皮细胞生长特性也与其相似[10] , 这与我们的原代培养发现的现象是一致的。胚胎来源的晶状体上皮细胞增殖能力和细胞形态上更为理想。但是实际中细胞的来源是一定的, 所以更关键的是取材后间隔的时间。间隔时间和保存条件可能更加影响细胞的活性。我们在培养中发现, 年龄较低的白内障患者(40～50 岁) 白内障术中取出的前囊膜置于培养基中在实验室立即进行培养, 可能较低温保存一天的眼库眼潜伏期更短。所以, 在原代培养中, 取材后间隔时间、供体年龄、取材部位对原代培养都是非常重要的因素。
原代细胞向成纤维细胞化生的现象在其他组织中很少见, 但却是后发性白内障发生的病理基础。研究界对此的关注不仅仅着眼于后发性白内障机理的研究和防治, 并且认为这种现象可能为其他疾病的治疗提供了新的治疗途径的可能[11] 。β 晶状体蛋白在20代左右的SRA01/04 细胞系的表达为阴性, 而在原代细胞表达呈阳性。所以, 我们认为细胞系具有可传代数高、增殖能力强的优点, 可在研究中广泛应用, 但是存在部分丧失了晶状体上皮细胞特性的缺点。与 SRA01/04 细胞系相比, 原代细胞表达组织特异性的β 晶状体蛋白,但是增殖能力有限。所以, 很多研究在细胞系水平研究的基础上, 通过组织培养在原代细胞水平进行验证, 可以使研究结果的可靠程度增加。
图3 63 岁年龄相关性白内障患者来源人晶状体上皮细胞
a: 第一代, 贴壁第 6 天, 细 胞 由 囊 膜 缘 爬 出 , 细 胞体积较胚胎来源细胞大, 胞质比例大(×40) ; b: 第一代, 贴壁第 9 天, 细胞体积大, 部分细胞呈纤维细胞形态(×40)
a: 第一代, 贴壁第 6 天, 细 胞 由 囊 膜 缘 爬 出 , 细 胞体积较胚胎来源细胞大, 胞质比例大(×40) ; b: 第一代, 贴壁第 9 天, 细胞体积大, 部分细胞呈纤维细胞形态(×40)
图4 a: 原 代 细 胞 (传至第三代 ) 蛋 白 ; b: SRA01 /04细胞蛋白; c: 晶状体皮质蛋白(阳性对照) ; 抗体: 兔抗人β 晶状体蛋白
基金
1. 国家自然科学基金资助项目( No. 30572003)
参考文献
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