高效液相色谱法测定曲伏前列素滴眼液中曲伏前列素含量
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关键词
摘要
全文
文章亮点
1. 关键发现
2. 已知与发现
3. 意义与改变
青光眼是以视神经损害和视野缺损为特征的眼病，属于一种常见的不可逆的眼部疾病，若不及时治疗，致盲率较高。其中，青光眼患者占比最多的是原发性开角型青光眼。
目前原发性开角型青光眼的治疗手段多以药物和手术为主，科学控制眼压，确保视神经不受损伤是临床治疗此病的基本准则。而药物治疗主要有前列素类药和β受体阻断剂等，曲伏前列素滴眼液属于前列素类药，主要通过增加房水经葡萄膜巩膜外流通道排出来降低眼内压，但不减少房水生成，具有持续稳定眼压的作用，无明显不良反应。无严重的或全身不良反应[1-17]，依从性好。目前，国内所用曲伏前列素滴眼液均是仿制进口的苏为坦，规格为0.004%(2.5 mL: 0.1 mg)，持有人为Novartis Europharm Limited。笔者翻阅各国药典，仅美国药典43版[United States Pharmacopoeia (43)，USP43]的曲伏前列素原料和曲伏前列素滴眼液质量标准有收载曲伏前列素含量测定项，方法为高效液相色谱法[18]，国内外有关的文献报道很少，如文献《高效液相色谱法测定曲伏噻吗滴眼液中曲伏前列素有关物质含量》报道曲伏前列素滴眼液的曲伏前列素含量检测时间较长，不利于药品实际生产中的过程控制。因此，笔者建立了曲伏前列素滴眼液中曲伏前列素的含量测定方法，为曲伏前列素的原料和制剂的质量控制提供了依据。
1 仪器与试药
1.1 仪器
高效液相色谱仪(Agilent 1260Ⅱ，包括四元泵、自动进样器、柱温箱、紫外检测器等)。1.2 试药
曲伏前列素对照品(USP，批号：R078A0，质量浓度：0.507 mg/mL)，曲伏前列素滴眼液[规格：0.004%(2.5 ml: 0.1 mg)，批号：22061401、22061402、22061403，中山大学中山眼科中心]，空白辅料溶液(批号：22061301，中山大学中山眼科中心)，乙腈(Dikma，批号：R142013，规格：4 L/瓶)为色谱纯，磷酸和氢氧化钠为分析纯，水为注射用水。2 方法与结果
2.1 色谱条件
采用Dikma C18色谱柱(50 mm×4.6 mm，3 μm)；以磷酸溶液(取磷酸1.0 mL，加水稀释并定容至1 000 mL，用1 mol/L氢氧化钠溶液调节pH至2.8)-乙腈(67:33)为流动相；流速为每分钟3.0 mL；柱温为25℃；检测波长为220 nm；进样体积30 μL。2.2 溶液的制备
2.2.1 溶剂乙腈-水(3:7)。
2.2.2 阴性供试品溶液
空白辅料溶液作为阴性供试品溶液。
2.2.3 供试品溶液
曲伏前列素滴眼液作为供试品溶液。
2.2.4 对照品溶液
精密量取曲伏前列素对照品0.8 mL，置10 mL量瓶中，用溶剂稀释至刻度，摇匀，即得浓度为40.56 μg/mL的对照品溶液。
2.3 验证内容
2.3.1 系统适用性试验精密量取对照品溶液30 μL，注入液相色谱仪，连续进样5次，记录色谱图。
2.3.2 专属性试验
按“2.1”项下色谱条件，取溶剂、对照品溶液、供试品溶液和阴性供试品溶液注入液相色谱仪，记录色谱图。
2.3.3 线性与范围
精密量取曲伏前列素对照品3 mL，置15 mL量瓶中，用溶剂稀释至刻度，摇匀，即得含曲伏前列素101.4 μg/mL的对照品储备液，精密量取对照品储备液适量，用溶剂定量稀释制成分别含曲伏前列素20.28、30.42、40.56、50.70、60.84和70.98 μg /mL的系列质量浓度溶液。按“2.1”项下色谱条件进行测定，以曲伏前列素浓度(C)为横坐标，峰面积(A)为纵坐标进行线性回归。
2.3.4 重复性
按“2.2”项下平行配制6份供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件，注入液相色谱仪，测定峰面积，计算每份样品的含量及含量RSD。
2.3.5 回收率试验
分别精密量取101.4 μg/mL的对照品储备液适量，置2 mL量瓶中，用曲伏前列素空白辅料滴眼液定量稀释制成含曲伏前列素规定量的80%、100%、120%的回收率供试品溶液，每种浓度各3份，共9份，按“2.1”项下色谱条件进样，测定峰面积，计算样品中曲伏前列素的回收率及回收率RSD。
2.3.6 溶液稳定性
分别取对照品溶液(40.56 μg /mL)和供试品溶液，置室温放置，在0、6、12、26、48 h内不同时间点按“2.1”项下色谱条件进样，测定对照品溶液和供试品溶液的峰面积，计算峰面积RSD。
2.3.7 耐用性试验
分别在柱温为20 ℃，25 ℃，30 ℃及流速为2.7，3.0，3.3 mL /min条件下测定样品中的曲伏前列素含量，以考察方法的耐用性，按“2.1”项下色谱条件，测定峰面积，并计算各色谱条件下样品中的曲伏前列素含量。
2.3.8 样品的含量测定
取按“2.2”项下制备的对照品溶液和供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进样，测定峰面积并记录色谱图，按外标法以峰面积计算曲伏前列素含量。
2.4 结果
2.4.1 系统适用性对照品溶液连续进样5次，理论板数按曲伏前列素峰计算均大于1 500，曲伏前列素峰面积的相对标准偏差小于2.0%，系统适用性良好。
2.4.2 专属性试验
结果显示：供试品溶液主峰与曲伏前列素对照品溶液中主峰保留时间一致，均为37.3 min。阴性供试品溶液不干扰曲伏前列素含量的测定(图1)。结果如图1所示。
1. Travoprost; A.Reference solution of Travopros; B. Testing solution; C. Control
2.4.3 线性与范围
以曲伏前列素浓度(C)为横坐标，峰面积(A)为纵坐标制作标准曲线图，结果如表1所示。
表 1 曲伏前列素线性与范围
Table 1 The linear and range of travoprost
|
溶液号 |
1 |
2 |
3 |
4 |
5 |
6 |
|
浓度（μg/mL） |
20.28 |
30.42 |
40.56 |
50.70 |
60.84 |
70.98 |
|
峰面积（A） |
172793 |
260572 |
350721 |
432507 |
526083 |
621458 |
取6份供试品溶液进样，按外标法以峰面积计算，结果6份供试品溶液中曲伏前列素平均含量为99.5%，RSD为0.8%(n=6)，表明该方法重复性精密度良好。
2.4.5 准确度试验
9份供试品溶液的曲伏前列素回收率在96.8%~ 102.5%之间，平均回收率为100.3%，RSD为2.0%(n=9)，表明该方法准确度良好。结果如表2所示。
表 2 曲伏前列素回收率实验结果
Table 2 Results of adding travoprost recovery
|
样品 |
测得量（μg） |
加入量（μg） |
回收率（%） |
平均回收率（n=3）（%） |
RSD（n=3）（%） |
平均回收率（n=9）（%） |
RSD（n=9）（%） |
|
1 |
29.45 |
30.42 |
96.8 |
98.4 |
1.6 |
100.3 |
2.0 |
|
2 |
29.99 |
30.42 |
98.6 |
||||
|
3 |
30.35 |
30.42 |
99.8 |
||||
|
4 |
40.81 |
40.56 |
100.6 |
101.9 |
1.1 |
||
|
5 |
41.58 |
40.56 |
102.5 |
||||
|
6 |
41.59 |
40.56 |
102.5 |
||||
|
7 |
51.7 |
50.70 |
102.0 |
100.7 |
1.7 |
||
|
8 |
50.08 |
50.70 |
98.8 |
||||
|
9 |
51.34 |
50.70 |
101.3 |
分别取对照品溶液和供试品溶液，置室温放置，分别在0、6、12、26、48 h按“2.1”项下色谱条件进样，对照品溶液和供试品溶液主峰面积RSD分别为1.2%和1.4%，表明对照品溶液和供试品溶液在室温条件下放置48 h稳定。
2.4.7 耐用性试验
当色谱条件发生柱温(25±5 )℃、流速(3.0±0.3)mL /min变化时，曲伏前列素含量RSD均小于2.0%，该方法耐用性良好。结果如表3所示。
表 3 耐用性试验结果
Table 3 Results of f durability test
|
组别 |
变化条件 |
主峰保留时间/min |
曲伏前列素含量/% |
含量RSD/% |
|
柱温/℃ |
20 |
41.937 |
99.2 |
0.4 |
|
25 |
39.028 |
98.8 |
||
|
30 |
35.991 |
99.5 |
||
|
流速/mL·min-1 |
2.7 |
41.600 |
98.6 |
0.8 |
|
3.0 |
39.028 |
98.8 |
||
|
3.3 |
35.898 |
97.4 |
3批制剂曲伏前列素含量测定结果见表4，按外标法以峰面积计算含量。检测结果符合标准规定。
表 4 三批曲伏前列素滴眼液的曲伏前列素质量分数结果
Table 4 Results of related substances in three batches of Trivoxetine eye drops
3 讨论
在临床上，曲伏前列素滴眼液通过缓解眼内血流阻塞，改善眼部血流动力学，降低眼内压，还可以抑制前列素的释放，减轻血-视网膜屏障损伤，恢复患者视功能[19]，是抗青光眼治疗的一线用药。该品种最早是由英国爱尔康公司开发，于2006年获得FDA批准，在2004年进入中国市场，截至目前，国家药品监督管理局已批准多家国内企业进行生产。本研究建立了曲伏前列素滴眼液的含量测定方法，并对方法进行了验证，结果表明该测定方法专属性强，准确度高，精密度好，可用于曲伏前列素滴眼液中曲伏前列素的质量分数测定，为曲伏前列素滴眼液的质量控制提供了依据。
笔者开发的方法与美国药典43版的曲伏前列素滴眼液质量标准曲伏前列素质量分数测定项及文献《高效液相色谱法测定曲伏噻吗滴眼液中曲伏前列素有关物质含量》中方法各参数对比见表5。
表 5 分析方法对比
Table 5 Comparison of Analysis Methods
利益冲突
所有作者均声明不存在利益冲突。开放获取声明
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