粤东地区外伤性眼内炎病原谱特征与分子诊断价值：基于培养和高通量测序的对比分析
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关键词
摘要
目的：旨在系统分析粤东地区外伤性眼内炎(posttraumatic endophthalmitis，PTE)的病原体分布特征及耐药性趋势，评估高通量测序(next generation sequencing, NGS)相较于传统微生物培养的诊断效能差异，为优化PTE诊疗策略提供循证依据。方法：回顾性纳入2019年1月—2025年1月期间汕头大学·香港中文大学联合汕头国际眼科中心收治的31例PTE患者临床数据。所有患者均接受微生物学检测(传统培养和NGS)，并完成标准化治疗与随访。采用χ2检验比较不同检测方法的病原体检出率和一致性。结果：共检出36种病原体，细菌占88.9%(32/36)，其中革兰阳性球菌(52.8%)以表皮葡萄球菌、肺炎链球菌和金黄色葡萄球菌为主；革兰阴性杆菌(36.1%)以克氏柠檬酸杆菌为主。真菌占11.1%(4/36)，主要为曲霉属。NGS的总体阳性率(80.6%)高于培养法(16.1%)(P<0.05)，额外检出病毒(EB病毒)及29.0%的混合感染病例。耐药性分析显示，青霉素G、复方新磺胺甲噁唑和苯唑西林是较常见的耐药抗菌药物，而NGS检测到2例携带耐药基因(如mecA、blaCTX-M)的病原体。结论：NGS技术显著提升了PTE病原体检测的灵敏度与特异度，尤其在识别混合感染、真菌及苛养菌方面具有突出优势。建议临床联合传统培养与NGS，以指导精准抗感染治疗。
全文
文章亮点
1 关键发现
• 发现高通量测序(next generation sequencing, NGS)检测病原体阳性率远高于传统培养（阳性率80.6% 比 16.1%），且能发现更多混合感染和罕见致病菌。另外，发现本地区外伤性眼内炎致病菌株分布特点。
2 已知与发现
• 过去已知外伤后容易发生细菌感染，培养法阳性率低。本研究发现本地区具体致病菌株分布情况与以往报道不同，并且NGS能极大弥补传统方法的不足，发现了很多过去查不出的病原体。
3 意义与改变
• 建议临床将传统培养和NGS结合使用，能更准、更快地找到病因，及时选择敏感抗菌药物，有望改善治疗效果。可根据本研究发现致病菌株特点来调整初始治疗方案。
外伤性眼内炎 (post-traumatic endophthalmitis, PTE) 是开放性眼外伤 (open globe injury, OGI) 后最严重的并发症之一，发生率约为2%~7%，占所有临床诊断眼内炎病例的20%~30%[1- 2]。PTE进展迅速，若未及时干预，可能导致不可逆的视力丧失甚至眼球摘除[3-4]。尽管玻璃体切割术联合广谱抗生素治疗已成为标准方案，但其预后仍不理想，30%~60%的病例最终视力低于20/400[1, 5-7]。这种高致盲性与病原体多样性、耐药性上升及混合感染的高风险密切相关[8-9]。传统微生物学诊断依赖培养法，但其灵敏度有限(30%~60%)[1, 10]，且耗时较长 (2~7 d)，难以满足临床快速诊断需求。尤其对于苛养菌、厌氧菌及真菌，培养法漏检率显著升高。近年来，高通量测序 (next-generation sequencing, NGS) 技术因其高灵敏度、快速检测能力及对混合感染的识别优势，逐渐成为感染性疾病诊断的重要工具[11-14]。然而，NGS在PTE中的应用仍缺乏大规模临床验证，其与传统培养法的互补价值尚未明确。
尽管多项研究探讨了PTE的预后因素[15-17](如眼内异物、延迟治疗)，但关于微生物学特征 (如真菌感染、混合感染) 与视力结局的关联仍存在争议[18-19]。此外，大样本数据匮乏及耐药性区域差异也限制了诊疗指南的优化。本研究通过分析粤东地区31例PTE病例，旨在明确病原体分布及耐药性特征和评估NGS与传统培养的诊断效能差异。
1 材料与方法
1.1 研究方案
本研究为单中心回顾性观察性研究，收集2019年1月—2025年1月期间在汕头大学·香港中文大学联合汕头国际眼科中心就诊的PTE患者的临床数据。研究方案经机构伦理委员会批准[批件号：EC 20231114(8)-P05]，并遵循《赫尔辛基宣言》原则，患者在接受治疗前均签署知情同意书。
1.2 纳入标准
OGI后确诊眼内炎(出现眼痛、视力下降、前房积脓或玻璃体炎)；完成微生物学检测 (直接涂片、培养及药敏试验和NGS检测)；随访时间≥2周 (眼球摘除或眼球萎缩病例)或≥ 1个月(解剖结构保留病例)。排除标准：其他类型感染性眼内炎(如内源性或手术源性)、缺乏微生物检测数据及随访时间不足。
1.3 数据收集与临床评估
收集纳入患者一般信息，如性别、年龄和受伤环境及季节等，外伤特征如致伤物类型 (金属、植物等)、损伤分区 (Ⅰ~Ⅲ区) 以及是否合并眼内异物 (intraocular foreign body, IOFB) 等。临床指标：初诊视力、前房及玻璃体炎症程度、眼底可见性和B超检查结果(脉络膜、视网膜脱离等)。治疗信息：手术方式、眼内填充物选择、全身及局部抗生素使用情况。微生物检测：取前房水或玻璃体送检完成致病微生物检测，包括直接涂片、培养及药敏试验和NGS检测。NGS检测出的病原体序列数对于临床致病微生物具有参考价值，通常认为序列数大于10 000具有较高的参考意义[20]。
1.4 统计学方法
使用均值和标准差对连续变量如患者的年龄进行描述性统计，使用百分比对分类变量如患者性别和不同致病微生物检出阳性率进行描述性统计。对2种检测结果做一致性分析。χ2检验被用于比较传统微生物培养与高通量测序对致病微生物检出阳性率差异。P<0.05被视为有统计学意义。
2 结果
2.1 研究对象一般信息和致伤特征
共纳入31例PTE患者的31眼。患者年龄为 (43.2±21.6) 岁 (范围：1~73岁)；83.9% (n=26) 为男性；18岁以下患者占16.1% (n=5)；合并球内异物患者占19.4% (n=6)；伤口自闭良好无需缝合患者占16.1% (n=5)，合并晶状体损伤患者占90.3% (n=28)。最常见致伤物为金属占58.1% (铁丝、铁钉和剪刀)，其次是石头、瓷砖和塑料占19.4% (表1)。末次访视最佳矫正视力<0.1者19例 (61.2%)，其中1例因无法控制的感染而行眼内容物剜除，0.1~0.5患者7例 (22.6%)，>0.5患者5例 (16.1%)。
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致伤物 |
患者人数(%) |
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金属(铁丝/铁钉/剪刀) |
18(58.1) |
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不明物体 |
4(12.9) |
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植物(草/木屑/树枝) |
2(6.5) |
|
爆炸伤 |
1(3.2) |
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石头/瓷砖/塑料 |
6(19.4) |
2.2 治疗方案
所有患者在一期手术时均采用经验性给予眼内注射抗生素，其中31例 (100%) 患者使用头孢他啶联合万古霉素。28例 (90.3%) 患者一期联合晶状体摘除手术，其中2例行单纯晶状体抽吸，2例行晶状体咬切，24例行白内障超声乳化吸除。6例 (19.4%) 患者在一期选择了非玻璃体切割手术治疗 (眼球壁伤口修补联合眼内注药术)，其中3例患者在术后1~3 d因眼内感染性炎症未能很好控制再次进行了玻璃体切割手术。硅油填充适用于严重视网膜血管炎、视网膜坏死或视网膜脱离高风险病例，空气填充用于轻度感染且无视网膜损伤者。28例行玻璃体切割术患者中，21例为硅油填充、7例为空气填充。其中1例患者在一期进行玻璃体切割联合硅油填充术后，感染性炎症仍未完全控制，而在1周后根据微生物培养结果再次进行了眼内注药。
2.3 微生物检测结果
微生物培养阳性患者5例 (16.1%)，NGS检测阳性患者25例 (80.6%)，2种检测技术阳性率的一致性，见表2。
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病例号 |
培养结果 |
NGS结果 |
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1 |
表皮葡萄球菌/ 耐甲氧西林葡萄球菌 |
表皮葡萄球菌/EB病毒 |
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2 |
树状微杆菌 |
阴性 |
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3 |
克氏柠檬酸杆菌 |
克氏柠檬酸杆菌 |
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4 |
嗜水气单胞菌 |
简氏气单胞菌/维氏气单胞菌/豚鼠气单胞菌/嗜水气单胞菌 |
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5 |
肺炎链球菌 |
肺炎链球菌 |
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6 |
阴性 |
阴性 |
|
7 |
阴性 |
表皮葡萄球菌 |
|
8 |
阴性 |
肺炎链球菌属 |
|
9 |
阴性 |
弗劳地枸橼酸杆菌/阿氏肠杆菌/表皮葡萄球菌 |
|
10 |
阴性 |
阴性 |
|
11 |
阴性 |
表皮葡萄球菌/溶血葡萄球菌 |
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12 |
阴性 |
表皮葡萄球菌/金黄色葡萄球菌 |
|
13 |
阴性 |
血红链球菌 |
|
14 |
阴性 |
微小不动杆菌 |
|
15 |
阴性 |
缓症链球菌 |
|
16 |
阴性 |
球毛壳菌 |
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17 |
阴性 |
停乳链球菌/脓肿分枝杆菌/黄曲霉 |
|
18 |
阴性 |
阴性 |
|
19 |
阴性 |
蜡样芽孢杆菌/表皮葡萄球菌 |
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20 |
阴性 |
表皮葡萄球菌/互隔交链孢霉 |
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21 |
阴性 |
表皮葡萄球菌 |
|
22 |
阴性 |
阴性 |
|
23 |
阴性 |
烟曲霉 |
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24 |
阴性 |
第三梭菌 |
|
25 |
阴性 |
EB病毒 |
|
26 |
阴性 |
产气荚膜梭菌 |
|
27 |
阴性 |
阴性 |
|
28 |
阴性 |
缓症链球菌/脑膜炎奈瑟菌 |
|
29 |
阴性 |
表皮葡萄球菌 |
|
30 |
阴性 |
表皮葡萄球菌 |
|
31 |
阴性 |
表皮葡萄球菌 |
从表2可以看出，NGS阳性率显著高于培养 (P<0.05)。NGS额外检出嗜水气单胞菌 (aeromonas hydrophila)、弗劳地枸橼酸杆菌 (citrobacter freundii)、树状微杆菌 (microbacterium arborescens) 等传统培养未覆盖的病原体。NGS与培养一致性比较中发现，完全一致率仅29.0% (9/31)，在培养检测阴性的24例患者中，NGS在其中21例 (87.5%) 患者样本中检测出致病微生物，其中病毒1例、混合细菌感染7例、真菌1例。
共计检测出36种致病微生物，其中细菌占88.9% (n=32)。29.0% (n=9)患者检测出混合微生物感染，其中1例为细菌混合真菌感染。NGS混合感染检出率25.8% (8/31)高于培养法3.2% (1/31) (P<0.05)。最常见的致病微生物为革兰阳性球菌占52.7%，其次为革兰阴性杆菌占19.4%。
由于西方国家不将表皮葡萄球菌列入致病菌，因此将此部分剔除后培养阳性率下降为12.9% (4/31)，NGS阳性率下降为51.6% (16/31)，由此可以看出NGS对于机会致病菌检出率高于传统培养。
2.4 耐药性分析
在耐药性分析中发现，培养法对检出的5例致病微生物阳性患者中的4例给出了药物敏感试验结果，1例表皮葡萄球菌和耐甲氧西林葡萄球菌阳性患者对青霉素、苯唑西林、红霉素和复方磺胺甲噁唑耐药，1例树状微杆菌阳性患者对头孢他啶、庆大霉素和妥布霉素耐药，1例嗜水气单胞菌阳性患者对头孢唑啉钠耐药，1例肺炎链球菌阳性患者对克林霉素、四环素和复方磺胺甲噁唑耐药。虽然NGS无法直接给出药物敏感性分析结果，但是有2例患者检测出耐药基因并给出对应耐药抗菌药物(CphA-碳青霉烯类抗生素，黏菌素耐药mcr基因/耐甲氧西林金黄色葡萄球菌相关 mecA 基因-甲氧苄啶/β-内酰胺类/大环内酯类-林可霉素类-链杆菌素)。
3 讨论
本研究通过对31例PTE患者的回顾性分析，揭示了病原体分布特征和耐药性趋势，并系统评估了NGS与传统培养法的诊断效能差异。本研究纳入的患者年龄为(43.2±21.6) 岁，83.9%为男性，与既往报道一致，再次提示青壮年男性是眼外伤主要人群[6]。需要强调的是在本研究中发现18岁以下患者占16.1%，可能与儿童受伤后未被及时发现并送医救治有关。最常见致伤物为金属，眼内异物存留占比22.6%，可能与本地区轻工业较发达，从事手工业和工程建筑相关工作工人较多有关。
在本研究中，革兰阳性球菌占52.8%，以表皮葡萄球菌和肺炎链球菌为主，与以往报道一致[8, 17]。革兰阴性杆菌占36.1%，以克氏柠檬酸杆菌为主，与以往报道一致[17]。克氏柠檬酸杆菌是一种常见于自然环境和人体肠道机会致病菌，免疫力低下和婴幼儿感染风险较高，其流行可能与本地区湿热的自然环境有关。真菌感染占11.1%，以曲霉属和镰刀菌属为主，略高于以往报道[1, 16]。NGS进一步揭示了传统培养漏检的4例霉菌感染(如球曲霉菌)，凸显其在环境真菌检测中的优势。此外，本研究中检出混合感染比例较高，这可能与粤东地区高温高湿环境、农业外伤常见、部分患者延迟就诊及基层抗生素滥用有关。
NGS的总体阳性率 (80.6%) 高于传统培养 (16.1%)，尤其在培养阴性病例中额外检出24例病原体 (如缓症链球菌、产气荚膜梭菌)。这一结果与Zhu等[11]的研究一致，证实NGS能够突破传统方法对苛养菌、厌氧菌及死菌的检测局限。此外，NGS在混合感染识别中的灵敏度(25.8% vs 3.3%)，同时给出的病原体序列数，序列数值越高，代表致病微生物可能性更大，为临床调整联合治疗方案提供了关键依据。
然而，NGS的局限性亦不容忽视，尽管其能检测耐药基因 (如meed、blácrx-M)，但表型耐药仍需传统药敏试验验证。NGS检测到EB病毒可能为潜伏感染或炎症过程中体内细胞的DNA裂解后释放而来，需结合临床判断其致病性。此外，NGS的高成本及生物信息学分析复杂性可能限制其在资源有限地区的普及。因此，我们建议将NGS作为培养阴性、复杂感染及高风险病例 (如土壤污染外伤) 的补充工具，而非完全替代传统方法。
随着玻璃体切割技术和设备的不断进步，玻璃体切割术在眼内炎中运用也日益增多，特别是联合硅油填充和眼内注射抗生素可以控制严重感染，同时减少术后视网膜脱离等并发症发生率[21-23]。在本组病例中，尽管笔者对所有患者进行了标准和及时的救治，包括对81.7%的患者进行了玻璃体切割手术，其中71.4%的患者进行了眼内硅油填充，以及95%联合使用了头孢他啶和万古霉素抗感染治疗，但是仍然观察到61.2%患者的视力低于0.1。在既往的文献报道中，PTE的视力受到多方面因素的影响，如真菌感染、延迟治疗和培养阳性的患者预后较差[1, 10, 24-25]，当然这些报道采取的治疗方式不完全相同。
本研究存在以下局限性：回顾性设计可能导致选择偏倚，尤其是轻症病例可能未被纳入。部分患者随访时间较短。未对真菌分离株进行药敏试验，限制了抗真菌治疗的精准指导。缺乏未发生眼内炎的OGI对照组，无法评估预防性抗生素的效果。
本研究系统揭示了PTE的微生物学特征及NGS的临床价值，因此倡导传统培养与NGS的联合应用，并依据地域性耐药数据优化经验性治疗方案。
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基金
1. 广东省医学科研基金(B2024255)。
This study was supported in part by Guangdong Province Medical Research Grant (B2024255).
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